Visų pirma, tiek EcoR1, tiek Xba1 virškindami DNR palieka 5' iškyšas (kaip ir Nde1). Abiem atvejais 3' galas yra įdubęs, todėl poliermasė gali pridėti pagrindo. Antra, visos polimerazės gali pridėti bazes tik prie 3' galo, todėl Klenow pridės 4 bazes prie abiejų vietų pasitraukusio 3' galo, kad sukurtų bukus galus.
Ar restrikcijos fermentai palieka 5 fosfatą?
Vektoriuose ir intarpuose, virškinamuose restrikcijos fermentais, yra būtinų galinių modifikacijų (5' fosfato ir 3' hidroksilo), o fragmentuose, sukurtuose polimerazės grandininės reakcijos (PGR) būdu, gali nebūti.
Ar galima perrišti bukus galus?
Buko galo perrišimas
Bukų galo perrišimas neapima išsikišusių galų poravimosi pagrindu, todėl bet koks bukas galas gali būti perrištas prie kito buko galo. Bukus galus gali sukurti restrikcijos fermentai, tokie kaip SmaI ir EcoRV.
Ar Taq polimerazė daro bukus galus?
Yes… Taq Polymerase prideda A-iškyšų, jei PGR išlaikote paskutinį pratęsimo žingsnį ties 72 dC. Dažniausiai naudojamas TA klonavimui.
Kodėl DNR sekos nustatymui naudoti Klenow fragmentą?
Klenow fragmentas itin naudingas atliekant moksliniais tyrimais pagrįstus uždavinius, tokius kaip: Dvigrandės DNR sintezė iš viengrandžių šablonų . Atsitraukusių 3' DNR fragmentų galų užpildymas, kad 5' iškyša būtų buka . Suvirškina išsikišusias 3' iškyšas.
